לפצח את הצופן החיידקי: כיצד פלסמידים פורצים את חומת האש המיקרוביאלית

לחיידקים יש מנגנוני הגנה רבים נגד דנ"א זר. במשך מיליארדי שנים, הם פתחו ארסנל מערכות שמטרתן לחסל חומר גנטי שמקורו מחוץ לתא. המערכת המפורסמת ביותר היא קריספר-קאס, שהקהילה המדעית רתמה בשנים האחרונות למטרות של עריכה גנטית. אולם קריספר היא רק דוגמה אחת מבין רבות. בשני העשורים האחרונים מחקרים חשפו למעלה מ-150 מערכות הגנה בקטריאליות שונות, מאנזימים שחותכים דנ"א ועד למערכות נגד פלישה זרה שמפעילות מנגנוני התאבדות של התא – כדי למנוע מהזיהום לעבור לשאר התאים במושבת החיידקים. ואפשר להניח כי מערכות אלה הן רק שבריר ממגוון המערכות שנמצאות בטבע.

פלסמידים טבעיים, שעוצבו גם הם על ידי מיליארדי שנות אבולוציה, פיתחו מענים מגוונים ורבי עוצמה לא פחות: כלי פריצה שמנטרלים את ההגנות הבקטריאליות. אולם בעוד שהצד המתגונן במרוץ חימוש זה קיבל תשומת לב רבה, אמצעי הנגד של הפלסמידים נותרו עד היום כמעט לא מוכרים. בטבע ישנם עשרות אלפי סוגי פלסמידים שונים, אבל עד היום הקהילה המדעית פענחה רק כלי סייבר אחדים שמשמשים כדי לפרק את "חומת האש" של מערכות חיסון בקטריאליות ספורות בלבד.

פער זה בהבנת הביולוגיה של פלסמידים הוא מוקד המחקר החדש של פרופ' דוד (דודו) בורשטיין מבית הספר שמוניס לביו-רפואה וחקר הסרטן. מענק ה-ERC החדש שהוא קיבל באחרונה מיועד למפות באופן שיטתי את כלי הפריצה שמקודדים ברצפים הגנטיים של פלסמידים בטבע ומשמשים לחדור את מערכת ההגנה של חיידקים שונים.

מיקום אסטרטגי

נקודת המוצא של המחקר היא אופן החדירה של פלסמידים לתוך התא. כדי להעביר פלסמידים, תא חיידקי מתחבר לתאים סמוכים דרך ערוצים זעירים שמיועדים להעברת דנ"א. הפלסמיד העגול השלם, שהוא מעין טבעת העשויה מהסליל הכפול המפורסם של שני גדילי דנ"א המתחבר לזנבו, לא מסוגל לעבור דרך הערוץ הצר. לכן, אחד מגדילי הדנ"א נחתך במיקום מסוים – שנקרא "מקור ההעברה" (Origin of transfer), או בקיצורoriT, ומשחרר את אחד הגדילים כדי שיוכל לעבור בצינורית. כתוצאה מכך, רצף הדנ"א הסמוך ל-oriT הוא הראשון שחודר את התא החדש.

"גילינו שהגנים המקודדים למערכות הפריצה של הפלסמידים מרוכזים מיד אחרי נקודת החיתוך, ומסודרים ככה שהם יהיו הראשונים שייכנסו לתוך התא החדש בתהליך ההעברה", מספר פרופ' בורשטיין. "מיקום אסטרטגי זה מאפשר הפעלה מהירה מאוד של כלי הפריצה, ומעניק לפלסמיד יתרון חיוני בהתגברות על מערכות ההגנה של התא הקולט".

הבעיה היא שבעוד שאנו יודעים כי האזור עמוס בגנים של כלי פריצה מולקולריים, מרביתם לא אופיינו עד היום. כלים חישוביים רגילים גם לא מסוגלים לזהות אותם באופן אמין כי הם תלויים בדמיון לרצפים שמקודדים לחלבונים מוכרים. ואכן, מגוון כלי הפריצה הזעירים נותרו נחבאים מעיני המדע עד היום.

קונטקסט גנטי
 

אחת השיטות שמשמשות את בורשטיין לחשוף את כלי הסייבר המולקולריים נסמכת על מקור מפתיע: בלשנות. מעבדתו היתה הראשונה לפתח את השימוש במודלי שפה גנומית, מערכות בינה מלאכותית ש"קוראות" גנים כמו מילים במשפט. בדיוק כפי שאנחנו יכולים לעתים קרובות לגלות מילה לא מוכרת לפי ההקשר בוא היא נמצאת ("השף חתך את הירקות עם ___ חד"), המודלים האלה מנבאים את התפקוד של גנים ספציפיים לפי ניתוח של מי הם השכנים שלהם על רצף הדנ"א.

"אם אנחנו רואים שגן לא מוכר נמצא לעתים קרובות בסמיכות למערכות אנטי-קריספר או קודים גנטיים למניעת חיתוך דנ"א באזור המוביל של הפלסמידים, ניתן לחזות את התפקיד שלו", מסביר פרופ' בורשטיין. גישה זו כבר חשפה כמה מועמדים מובילים: משפחות של חלבונים בעלי דמיון מבני למערכות אנטי-קריספר מוכרות ולפקטורים שמונעים חיתוך גנים, אפילו שהדמיון ברצף הדנ"א עצמו הוא נמוך.

גישת מחקר נוספת היא הנדסה לאחור של המטרות של אותם כלי סייבר מולקולריים. "אם אנחנו יודעים אילו מערכות הגנה קיימות באוכלוסיות חיידקים מסוימות, ניתן לחזות אילו כלי פריצה יעילים כדאי לחפש בפלסמידים שמצליחים להדביק אוכלוסיות אלה", מוסיף פרופ' בורשטיין. בניתוח דגימות של חיידקי אי קולי שנאספו מחולים, במעבדה של פרופ' בורשטיין כבר הצליחו לאפיין רפרטואר שלם של מערכות הגנה של אותם פתוגנים, מבססים מפה של "חומות אש" אותן הפלסמידים נדרשים לפרק.

שאלה של תזמון
 

אולם הזיהוי הוא רק השלב הראשון. הקודים הגנטיים המשמשים לפריצת חומת האש החיידקית צריכים להתבטא בתזמון מושלם, במשך חלון הזדמנויות צר שבו הפלסמיד חודר לתא אבל האזעקות של החיידק עוד לא הופעלו בעוצמה. תזמון מדויק זה נקבע על ידי מתג גנטי ייחודי שנותר עד היום מסתורי למדי.

האתגר של הפלסמיד הוא שבכניסה לתא, הוא מופיע בתור גדיל יחיד, ורק בתוך התא החדש גדיל זה משמש תבנית לבנייה של הגדיל המשלים. אולם ביטוי גנים – שעתוקם למולקולות רנ"א שאז מתורגמות לחלבונים של ידי הריבוזום - מתרחש בדרך כלל רק בדנ"א דו-גדילי. המכונות המולקולריות שאחראית על תפקיד זה בנויות לקרוא את הסליל הכפול ולא גדיל יחיד. לפיכך, לכאורה הגנים של הפלסמיד אמורים להיוותר לא פעילים באותם רגעי מפתח של התקפת הסייבר המולקולרית.

למצב החד-גדילי יש גם יתרון: כמו המנגנונים שמשעתקים דנ"א לרנ"א, גם מערכות ההגנה החיידקיות פועלות בדרך כלל רק נגד דנ"א דו גדילי. אולם מדובר בהגנה לא מלאה וזמנית. מעבר לכך, כדי לבטא את החלבונים שלו, הפלסמיד צריך למצוא דרך להפוך לדו-גדילי, ואז ארסנל ההגנות של החיידק מזנק לפעולה בשיא הכוח.

כך שהפלסמיד צריך לייצר את "חלבוני הסייבר" שלו לפני שהדנ"א שלו הופך לדו-גדילי ופגיע להתקפות, אולם ייצור חלבונים תלוי בקיומו של אותו דנ"א דו-גדילי. פלסמידים בטבע פותרים פרדוקס זה בעזרת תכסיס אלגנטי: רצפי דנ"א חד-גדילי עם שני חלקים כמעט זהים אך הפוכים (רצפי מראה) שיודעים להתקפל על עצמם בצורה שמזכירה סיכת שיער גמישה. בקיפול זה, כל אות בדנ"א מתחברת לאות המשלימה שלה ברצף המראה, ויוצרת מקטע דו-גדילי, המכונה פרומוטר, שמאפשר קידוד חלבונים.

שיטה זו כוללת מנגנוני תזמון ובקרה עצמית. ברגע שהסינתזה של הגדיל המשלים של הפלסמיד מתחילה, סיכת השיער הגמישה מתיישרת, והרצף מתחבר לרצף המשלים האמיתי שלו במקום לעצמו. עם ההתיישרות, גם הייצור של החלבונים שהרצפים של סיכת השיער הגמישה קודדה להם נפסק, ופרומוטרים אחרים נכנסים לפעולה ומעודדים את הקידוד של חלבונים אחרים שחיוניים לפלסמיד כדי להשתמר בתא ולהשתכפל.

התכסיס מהווה מעין שעון עצר ביולוגי שמפעיל את מערכות הסייבר מיד לאחר הפריצה לתא החדש, ישירות מהדנ"א החד-גדילי, ומנטרל אל מערכות ההגנה של התא המאכסן. עד שהאזעקות מופעלות והחיידק מתחיל להשיב מלחמה שערה, הקוד הזדוני של הפלסמיד כבר מותיר אותו עם המכנסיים למטה.

אולם למרות חשיבותם, הפרומוטרים החד-גדיליים כמעט ולא נחקרו עד יום, והתפקוד של פרומוטרים יחידים, שמקורם בשני פלסמידים בלבד, אופיין במעבדה. הניתוח הראשוני של בורשטיין, בשיטות חישוביות, כבר חשף מעל ל-10,000 מועמדים פוטנציאליים לפרומוטרים חד-גדיליים במגוון רב של פלסמידים. מרביתם מהווים טריטוריה לא מוכרת לבקרה של פעילות כלי הסייבר המולקולריים, שזוהו רק בזכות החיזוי של צורת סיכת הראש שהם מסוגלים ליצור, לא בעקבות ניתוח הרצפים שלהם.

"הבנת הפרומוטרים חיונית משתי סיבות", מסביר פרופ' בורשטיין. "ראשית, הם מלמדים אותנו אודות התזמון והתיאום של ההתקפה הרב שכבתית של הפלסמיד על מערכות ההגנה חיידקיות. שנית, אם אנחנו רוצים להנדס פלסמידים יעילים יותר לשימושים ביו-טכנולוגיים, אנחנו צריכים להיות מסוגלים לשלוט בתזמון של הפעלת כלי הסייבר הללו בעצמנו.

מאבק רב זרועי

השלב האחרון בפרויקט המחקר של פרופ' בורשטיין מיועד להבין כיצד מגוון כלי הסייבר של הפלסמידים פועלים בתיאום זה עם זה. לחיידק אין רק מערכת הגנה אחת, אלא מגוון קווי הגנה שונים, שכל אחד מהם מיועד לפעול נגד מאפיין שונה של הדנ"א הזר. פלסמיד יעיל חייב להתגבר על כל המערכות הללו כדי לשרוד.

"המחקר שלנו יאפשר בעתיד לתכנן פלסמידים יעילים בהרבה למניפולציות גנטיות של חיידקים למטרות תעשייתיות", מסביר פרופ' בורשטיין. "פלסמידים כבר משמשים רבות למטרות אלה, אבל היעילות שלהם בהעברת מידע גנטי בתנאים תעשייתיים נמוכה בהרבה ממה שאנו מוצאים בטבע, בפלסמידים שנוצרו בעקבות מיליארדי שנות מרוץ חימוש מולקולרי". בניגוד לכך, פלסמידים סינטטיים "נשלחים לשטח" לרוב ללא הקוד הנדרש כדי לחדור את חומת האש של החיידק. באיסוף מערכות פריצה אלה, אפיון הגורמים השולטים בפעולתם וכיצד הם פועלים בשילוב זה עם זה, המחקר מיועד לספק את ארגז הכלים הדרוש להנדסה של פלסמידים שמסוגלים אפילו לפעול ביעילות על חיידקים בטבע.

"התקדמות זו תפתח את הדלת לתכנון של פלסמידים יעילים למניפולציה גנטית של אוכלוסיות חיידקים טבעיות", מוסיף בורשטיין. "אם זה כדי לנטרל עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים בבתי חולים, 'ללמד' חיידקים באדמה ומים לפרק מזהמים או לקבע פחמן דו חמצני, או לעשות מניפולציות על חיידקי המיקרוביום של המעיים כדי לשפר את בריאותנו".

נסתרים מעינינו אך בכל מקום סביבנו, חיידקים ופלסמידים נמצאים במרוץ חימוש לא פוסק לפיתוח מערכות הגנה ופריצה. במיפוי כלי הסייבר של צד אחד וחומות האש של הצד השני, נוכל אולי לגלות כיצד להטות את המרוץ לצד המועדף עלינו, בין אם זה כדי למנוע התפשטות של פלסמידים מסוכנים, או כדי לרתום את שיטת העברת המידע הגנטית המופלאה הזו למטרותינו.